Наук, доцент В. В. Тюрин 2015 г. Выпускная квалификационная работа бакалавра чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, выделенных в краснодарской краевой клинической больнице №2
Скачать 122,93 Kb.
|
vypusknaya rabota 2
| Klebsiella pneumoniae, подобно кишечной палочке, не всегда априори обладает антибиотикорезистентностью, но легко приобретает это свойство посредством плазмид. Большой резонанс в исследовательских кругах вызвало обнаружение плазмидо-ассоциированной карбапенемазы у K. pneumoniae. Особого внимания заслуживает еще один представитель рода клебсиелл – K. oxytoca, который, хотя и уступает K. pneumoniae по патогенному действию, но, выступая в роли оппортуниста, может вызывать госпитальные пневмонии, ИМП и даже смертельные септические состояния. Главной причиной является почти постоянная множественная резистентость K. oxytoca, включающая карбапенемы, амикацин и фторхинолоны [Демиховская, 2011].
Возбудители из рода Enterobacter (E. cloacae, E. aerogenes) встречаются гораздо реже, чем патогены из рода кишечной палочки, но сопоставимы по частоте с клебсиеллами. Вопрос их патогенности долгое время оставался открытым. В настоящее время признано, что энтеробактеры выступают как оппортунисты на фоне длительной антибиотикотерапии и встречаются при тяжелых госпитальных инфекциях (сепсис, пневмония, перитониты, тяжелая уроинфекция). Кроме природных хромосомных β-лактамаз, они нередко имеют плазмидные БЛРС и карбапенемазы [Sheldon, 2005]. Основу лечения ИМП (инфекции мочевыводящих путей), вызываемых представителями семейства Enterobacteriaceae, составляют β-лактамные антибиотики из группы аминопенициллинов, среди которых наиболее часто применяют ампициллин. Выбор конкретных препаратов для лечения основывается на данных о природной активности антибиотиков. Ампициллин имеет довольно широкий спектр антимикробного действия: к нему чувствительны многие грамотрицательные и грамположительные бактерии [Вертегел, Овчаренко, 2010]. У беременных женщин он может успешно заменять более токсичные тетрациклины, левомицетин и стрептомицин [Алексеева, Сафронова, 2014]. Сложность лечения аминогликозидными препаратами состоит в том, что способность к конъюгативной передаче плазмид, содержащих в своем составе гены резистентности к аминогликозидам, значительно осложняет терапию госпитальных инфекций. В процессе конъюгации детерминанты резистентности, например, к амикацину, гентамицину, передаются не только между представителями одного семейства Enterobacteriaceae, но и между представителями разных семейств, например, от штаммов P. aeruginosa. Тем не менее, не было отмечено ни одного случая передачи резистентности к гентамицину или амикацину у штаммов Acinetobacter spp., и единичные случаи у штаммов Proteus spp. [Решедько, 2011]. 1.4 Проблема резистентности энтеробактерий, выделенных от больных урологического отделения к антимикробным препаратам В настоящее время в РФ отмечается существенный рост устойчивости уропатогенов к амоксициллин/клавуланату и, возможно, к амоксициллин/сульбактаму. Устойчивость кишечной палочки, на долю которой приходится до 90 % внебольничных урогенитальных инфекций, к защищенным пенициллинам превысила 20 %. В связи с этим, данные антибиотики не могут рассматриваться как средства первого ряда [Яковлев, 1999]. В последние годы отмечено существенное увеличение устойчивости Enterobacteriaceae к цефалоспоринам. Устойчивость к цефокситину выявлена у 34,6 % клебсиелл и 30,4 % кишечной палочки [Белоусов, Моисеев, Лепахин, 2006]. Наиболее важный механизм устойчивости грамотрицательных бактерий к цефалоспоринам связан с продукцией бета-лактамаз, причем наибольшую угрозу представляют бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), способные гидролизовать цефалоспорины широкого спектра. К наиболее распространенным ферментам с хромосомной локализацией генов относятся бета-лактамазы класса C (AmpC). БЛРС гидролизуют большинство антибиотиков – пенициллины, цефалоспорины 1, 2, 3 поколений (частично – 4 поколения) и азтреонам [Эйдельштейн, 2001]. Частота выделения штаммов K. pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра составляет: 45 % в Латинской Америке, 25 % в западно-тихоокеанском регионе, 23 % в Европе, 8 % в США, 5 % в Канаде, а частота выделения E. coli в Европе – 14,4 % [Супотницкий, 2011]. Кроме того, микроорганизмы, продуцирующие БЛРС, часто устойчивы к другим классам антибиотиков, включая аминогликозиды и фторхинолоны. Таким образом, энтеробактерии, продуцирующие БЛРС, можно определенно отнести к полирезистентным бактериям [Поляк, 2012]. Особенно быстрое распространение мультирезистентных штаммов E. coli связывают с транзиторной контаминацией этими изолятами рук медицинского персонала, окружающей среды, а также использование антимикробных препаратов [Богун, 2007]. Отдельные представители семейства Enterobacteriaceae (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens, Providencia spp.) демонстрируют способность к продукции хромосомных цефалоспориназ, характеризующихся высоким сродством к цефалоспоринам 3-го поколения. Индукция или угнетение этих хромосомных бета-лактамаз в период применения цефалоспоринов 3-го поколения в итоге приведет к формированию резистентности ко всем доступным цефалоспоринам. Распространение данной формы резистентности увеличивается в случаях лечения инфекций, прежде всего вызываемых Enterobacter cloaceae, цефалоспоринами широкого спектра действия [Резистентность микроорганизмов…, 2008]. Однако в настоящее время среди представителей семейства Enterobac-teriaceae обнаруживается значительное увеличение доли ампициллинрезистентных штаммов. Кроме того, со временем видовой спектр и антибиотикочувствительность возбудителей ИМП в любой клинике претерпевают изменения, что диктует необходимость постоянного бактериологического мониторинга, строгого контроля над проведением антибактериальной терапии в клиниках. Включение ампициллина в набор для тестирования Enterobacteriaceae объясняется не столько клиническим значением этого антибиотика, сколько важностью для оценки фенотипа исследуемого микроорганизма и внутреннего контроля качества [The use of antibiotics, 1997]. Таким образом, причина сложности антибактериальной терапии при лечении больных урологического отделения связана с тем, что многие микроорганизмы (особенно госпитальные штаммы) часто характеризуются полирезистентностью, т.е. устойчивостью к трем и более антибиотическим препаратам [Определение чувствительности гонококков…, 2003]. 1.5 Проблема внутрибольничных инфекций Интерес представляет видовой состав возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ), который варьирует в зависимости от профиля медицинского стационара и региона. По данным официальной медицинской статистики в России регистрируется около 30-50 тысяч случаев ВБИ в год (при среднем показателе 0,9 эпизодов на 1000 пациентов). Следует учитывать, что истинная заболеваемость и смертность значительно превышают регистрируемую. При этом продолжительность пребывания больного в стационаре возрастает на 6-8 дней. Вовлечение в эпидемиологическую структуру заболеваемости медицинского персонала (по официальным данным Роспотребнадзора составляет около 1,5 тысяч человек в год), требует не только пристального внимания к данной проблеме, но и к поиску путей ее решения. Тяжесть ситуации усугубляется тем, что повсеместная антибиотикопрофилактика ВБИ и лечение больных с этим видом заболеваний приводит к появлению и распространению резистентности у условнопатогенных бактерий к антимикробным препаратам. Проблема антибиотикорезистентности выходит за пределы медицинских учреждений, затрудняя лечение инфекций, распространяющихся среди населения [Глущенко, Лямин, Круглов, 2014]. По сравнению с 2000 – 2004 гг. произошли некоторые изменения в структуре возбудителей внутрибольничных заболеваний. Заметно уменьшилась доля неферментирующих бактерий (в основном Pseudomonas aeruginosa) с 40-50 % в 2000 – 2004 гг. до 18 % в 2011 – 2013 гг. Впрочем, отмечается тенденция к нарастанию случаев выявления Acinetobacter spp. По-прежнему высокой с явной тенденцией к росту оставалась доля Enterobacteriaceae spp. (в основном E. coli, Klebsiella spp., Serratia spp.): 36 – 40 % в 2000 – 2004 гг. и 53 % в 2011 – 2013 гг. Обращало внимание заметное нарастание доли стафилококков. Если в 2000 – 2004 гг. доля Staphylococcus spp. (в основном Staphylococcus aureus) была в анализируемых стационарах всего 3 %, то в 2011- 2013 гг. доля этих микроорганизмов возросла до 16 %. Энтерококки выделялись в единичных случаях [Особенность микробного пейзажа…, 2012]. 1.6 Основные возбудители семейства Enterobacteriaceae в хирургическом отделении Как известно, хирургическое отделение одно из самых «стерильных» отделений больницы, в котором большая работа направлена на уменьшение содержания микроорганизмов, как в воздухе, так и на предметах мебели. Несмотря на огромный прогресс в современных методах асептики и антисептики, а также противобактериальной терапии, число осложнений после перенесенной операции не уменьшилось со времен активного внедрения антибиотиков в медицину, а в некоторых случаях даже увеличилось. Связывают это явление с резистентностью микроорганизмов вследствие нерационального использования антибактериальных препаратов. В связи с этим проведение мониторинга микроорганизмов, выделяющихся у больных в хирургическом отделении, является актуальной задачей, предопределяющей алгоритм этиотропной терапии больных данной патологией [Безбородов, Донецкая, 2014]. В результате проведенных исследований в различных лечебно-профилактических учреждений было выявлено, что в отделении преобладают грамотрицательные микроорганизмы, на долю которых приходится 73,52 %. Среди них превалируют виды: Escherichia coli (17,65 %), Enterobacter cloacae (14,7 %), Pseudomonas aeruginosa (11,77 %). При анализе компонентного профиля госпитальных инфекций было обнаружено, что 94,12 % из них являлись моноинфекциями и 5,88 % двухкомпонентными полиинфекциями. Оценивая антибиотикорезистентность микроорганизмов, было обнаружено, что Escherichia coli наиболее резистентена к карбенициллин и ампициллину. Большинство штаммов кишечной палочки чувствительно к имипенему и меропенему, цефепиму. Штаммы Enterobacter cloacae устойчивы к ампициллину и ципрофлоксацину. Наибольшая чувствительность наблюдается к гентамицину. Для снижения частоты инфекционных осложнений необходимо учитывать механизмы устойчивости ведущих возбудителей. Особое внимание должно уделяться резистентности к полусинтетическим пенициллинам (ампициллину и карбенициллину) у ведущего числа микроорганизмов, и к цефотаксиму и ципрофлоксацину у энтеробактерий [Бабаев, Митрофанова, Мельников, 2012]. 1.7 Основные возбудители семейства Enterobacteriaceae отделения реанимации и интенсивной терапии В микробном пейзаже возбудителей внутрибольничных инфекций превалирует грамотрицательная флора (75 % выделенных штаммов), при этом в большинстве случаев в качестве этиологически значимых микроорганизмов выявлены P. aeruginosa 50 %, в равных долях E. coli и S. epidermidis – по 17 % каждая, в меньшей степени Enterobacter – 14 % и Acinetobacter – 11 %. В 14 % случаев обнаружены ассоциации микроорганизмов [Киреев, Матвеенкова, 2014]. Данные по антибиотикочувствительности основных представителей энтеробактерий, изолированных в ходе исследования, свидетельствуют об устойчивости данных изолятов к пенициллинам и цефалоспоринам 2 поколения. Кроме того, большинство культур было нечувствительно к цефепиму. В отношении K. pneumoniae среди аминогликозидов наилучшие показатели отмечены у амикацина. Отличительной особенностью E. coli было сохранение у 30 % штаммов природной чувствительности к ампициллину. В группе аминогликозидов как наиболее значимый препарат отмечен амикацин (30 %). Активность фторхинолонов была в 15 % случаев. Учитывая, что большинство штаммов E. coli выделено из послеоперационных ран, и данный вид является представителем нормальной микрофлоры кишечника, можно предположить примерно в 1/3 случаев (когда выделяются культуры, обладающие хорошей чувствительностью) эндогенное инфицирование [Решедько, 2011]. 1.8 Основные возбудители семейства Enterobacteriaceae пульмонологического отделения Инфекции дыхательных путей по частоте возникновения занимают первое место среди инфекционных заболеваний человека. Основными внеклеточными возбудителями внебольничной пневмонии являются Streptococcus pneumoniae (до 50 %) и Haemophilus influenzae, среди внутриклеточных – Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. и Chlamydia spp. Обострение хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) в каждой отдельной ситуации может быть связано с особенностями микрофлоры индивидуума и степенью нарушения вентиляционной способности легких, но наиболее часто обострение ХОБЛ обусловлено H. Influenzae (46 %), S. Pneumoniae (26 %) и Moraxella catarrhalis. Следовательно, микрофлора, вызывающая инфекции нижних дыхательных путей, является сходной, лишь с некоторым преобладанием тех или иных возбудителей, значит, и антибактериальная терапия может оказаться идентичной. Представители семейства Enterobacteriaceae встречаются довольно редко, среди них можно назвать Escherichia coli [Багишева, Мордык, Рассказова, 2014]. 1.9 Основные возбудители семейства Enterobacteriaceae ожогового отделения Проблема внутрибольничного инфицирования остается одной из самых актуальных для хирургических стационаров, так как оказывает значительное влияние на длительность госпитализации и уровень летальности. Особую значимость она приобретает для пациентов с ожоговой травмой: считается, что до 75% всех смертельных случаев после термических ран вызвано инфекционными осложнениями. Их возникновение и развитие обусловлено различными факторами: природой самого ожога, ослабленным иммунным статусом пациентов, агрессивными диагностическими, терапевтическими процедурами и длительными сроками госпитализации. В ожоговых отделениях видовой спектр возбудителей инфекционных осложнений и их антибиотикочувствительность зависят от климатических и региональных особенностей, применяемых в отделениях антибактериальных препаратов, и могут существенно изменяться со временем [Особенности инфицирования…, 2014]. Наиболее частой причиной раневых нагноительных процессов являются грамположительные микроорганизмы, на долю которых приходится 49,2 % всех выделенных культур. Из них чаще высевались Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Из грамположительных микроорганизмов часто выделяли и других представителей рода Staphylococcus – S. epidermidis и S. haemolyticus, а также Corynebacterium xerosis, Enterococcus faecalis. Значимыми среди грамотрицательных бактерий были A. baumannii, Klebsiella spp., Enterobacter cloacae. Удельный вес остальных видов не превышал 5 %. Большая часть выделяемых в ожоговом отделении штаммов A. baumannii являются полирезистентными и зачастую устойчивы к ампициллину/сульбактаму и ципрофлоксацину [Воробьева, Денисенко, Дощицина, 2007]. 2 Материал и методы исследования Работа проводилась с января по сентябрь 2014 года в баклаборатории Краснодарской краевой больницы №2. Все исследования проведены согласно методическим указаниям МУК 4.2.1890-04 [Определение чувствительности микроорганизмов..., 2004 года] и «Практическому руководству по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи» [Зубков, 2002]. 2.1 Объект исследования Объектом исследования служили моча и отделяемое цервикального канала больных урологического отделения. Всего было проанализировано 722 пробы, содержащих штаммы Enterobacteriaceae (708 проб мочи и 14 проб из цервикального канала). От пациентов других отделений были взяты на исследование кровь, ликвор, пунктаты, моча и раневое отделяемое. 2.2 Среды для культивирования микроорганизмов - Среда Уриселект 4 - неселективная среда для изолирования и подсчета микроорганизмов из мочевого тракта; прямой идентификации E. coli (розовые колонии), Enterococcus (синие колонии), Proteus (коричневые колонии); предварительной идентификации KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia). Позволяет через 18 ч после посева идентифицировать до 80 % изолятов [Зубков, 2002]. - Питательные среды для посева мочи и отделяемого ц/к. - Кровяной агар. К 100 мл расплавленного сухого питательного агара, производства компании «Biomerieux», Франция, добавляли 5 мл дефибринированной крови человека [Зубков, 2002]. - Мак–Конки среды (А. Т. Mac Conkey) – дифференциально-диагности-ческие среды, применяемые для обнаружения и выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных бактерий из различных материалов. Колонии кишечной палочки на агаре Мак-Конки ярко-красного цвета [Зубков, 2002]. - Олькеницкого среда (трехсахарная среда с мочевиной). Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. Применяют для накопления и дифференциации Enterobacteriaceae. Позволяет определить у исследуемой культуры ферментацию углеводов, мочевины, образование сероводорода [Зубков, 2002]. - Среда Симмонса. Эта среда используется для дифференциации представителей семейства Enterobacteriaceae по способности использовать цитрат в качестве источника углерода. Ассимилирующие цитрат культуры дают рост и изменяют цвет среды на синий, не ассимилирующие цитрат – не дают роста и не меняют цвет среды [Зубков, 2002]. - Среда Кларка - жидкая дифференциально-диагностическая питательная среда для определения у микроорганизмов интенсивности кислотообразования при расщеплении глюкозы и способности продуцировать ацетилметилкарбинол; содержит пептон, глюкозу, гидрофосфат калия и индикатор. Добавление индикатора метилового красного к культурам Escherichia coli приводит к появлению красного окрашивания ввиду сильного закисления среды в результате ферментации глюкозы [Зубков, 2002]. 2.3 Выделение энтеробактерий из исследуемого материала Этот этап заключается в изучении характера роста на питательной среде, интерпретации визуальной характеристики выросших колоний и отборе их для получения чистой культуры и первичной идентификации. Учитывают, прежде всего, морфологическую характеристику колоний, пигментообразование, наличие специфического запаха (например, у бактерий рода Citrobacter), изменение цвета среды. Ведущее значение имеет дифференциация по окраске изолированных колоний, которую определяют особенности метаболизма бактерий в отношении дифференцирующих субстратов питательной среды. Таким субстратом в большинстве случаев является лактоза. Соответственно и колонии, образованные бактериями, не расщепляющими ее, выглядят бесцветными или имеющие оттенок цвета самой среды. Такие колонии подлежат первоочередному отбору (отсеву), так как могут быть образованы патогенными энтеробактериями (шигеллами, сальмонеллами и т.д.) и условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ) (гафния, провиденция, серрация и др.). Многие штаммы УПЭ способны ферментировать лактозу с различной интенсивностью и образуют разной степени окрашенные колонии. Поэтому для дальнейшего изучения следует отсевать не менее 3-5 колоний каждого вида, особенно при первичной этиологической расшифровке диарейных заболеваний в очагах [Гиссенс, 2001]. Методика взятия колоний для выделения чистой культуры проста, но имеет большое значение. Дело в том, что используемые питательные среды (особенно высокоселективные) действуют, в основном, бактериостатически, и микробы-спутники, не развиваясь на них, сохраняют жизнеспособность, а значит, представляют опасность загрязнения колоний искомых энтеробактерий. Колонию следует снимать тонкой бактериологической петлей прикосновением к центру колоний. Недопустимо охлаждение петли о визуально свободную от роста поверхность среды. Отобранные колонии отсевают на многотестовые (комбинированные) среды для накопления чистой культуры и ее предварительной идентификации [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]. 2.4 Методы идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae Со среды Эндо снимают подозрительные колонии и засевают уколом в столбик среды Олькеницкого. После 24-часовой инкубации при 37 ºC делают предварительное заключение о родовой принадлежности выделенных культур [Зубков, 2002].
В лабораториях лечебных учреждений чаще применяется диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности, основанный на способности антибактериального препарата диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара. Для определения чувствительности ДДМ используют плотную питательную среду и стандартизированные диски, изготовленные в специализированных лабораториях. При измерении зон задержки роста ориентируются на зону полного подавления видимого роста [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]. Помимо ДДМ чувствительность микроорганизмов определяют при помощи системы для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact, в основу которой положен метод серийных разведений. Автомат производит разведение культуры бактерий и засевает им специальные кассеты с уже нанесенными антибиотиками. После 7-8 часов инкубации при 37 ºC аппарат передает данные в компьютер в виде таблицы, на которой отображается устойчивость к антибиотикам [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]. Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом применялись диски производства НИЦФ, Санкт-Петербург, компании Biomerieux, Becton Dikinson, Франция, диски с нитроцефепином для определения наличия бета-лактамаз производства Челябинского НИИИФ. Для идентификации микроорганизмов используется также система для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact производства компании «Био-мерье», Франция [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]. Список антибиотиков, применяемых при ручном методе определения чувствительности [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]:
Список антибиотиков, применяемых на системе для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact исключительно для определения устойчивости штаммов Enterobacteriaceae [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].
3 Чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, выделенных в Краснодарской краевой клинической больнице №2 3.1 Устойчивость к антибиотикам штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных от больных урологического отделения ГБУЗ ККБ №2 Нами совместно с сотрудниками баклаборатории проводились исследования этиологии гнойно-септических осложнений в урологическом отделении ГБУЗ ККБ №2. Определение устойчивости к антибиотикам выделенных культур было нашей основной задачей. Всего было выделено 722 пробы, содержащие штаммы Enterobacteriaceae (таблица 1). Таблица 1 – Частота обнаружения микроорганизмов в пробах клинического материала от больных, январь 2013 года – сентябрь 2014 года.
В таблице 1 показано, что большая часть проб была выделена из мочи пациентов (96 % проб). На долю проб, содержащих биоматериал из выделений цервикального канала, приходится всего 4 %. Всего в отделении с января 2013 по сентябрь 2014 года выявлено 70 представителей различных семейств, из них 20 относятся к семейству Enterobacteriaceae. Остальные микроорганизмы относятся к неферментирующим бактериям (рода Acinetobacter, Pseudomonas), бактериям родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus и дрожжеподобным грибам (род Candida). Перечень выделенных в урологическом отделении бактерий, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae: Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae ssp. cloacae, Enterobacter koberi, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae ssp. oxytoca, Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae, Kluyvera ascorbata, Morganella morganii, Morganella morganii ssp. morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Serratia liquefaciens group, Serratia marcescens. В таблице 2 приведены данные об общем количестве наиболее часто встречающихся штаммов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, обнаруженных в биоматериале, их видовой принадлежности, и указан процент встречаемости отдельного штамма к общему числу исследованных микроорганизмов. Таблица 2 – Частота выделения основных видов семейства Enterobacteriaceae в урологическом отделении в период с января 2013 года по сентябрь 2014 год
Скачать 122,93 Kb. Поделитесь с Вашими друзьями:
|